激光熒光共聚焦顯微鏡的工作原理

背景

激光熒光共聚焦顯微鏡（CLSM）是近代先進的細胞生物分析/儀器之一。是在1957年，Marvin Minsky首先提出這一概念，經過多年的發展才實現顯微鏡所需要的激光束掃描技術，點對點掃描構建二維圖像以及到后期根據多張二維光學圖像構建三維圖像。激光共聚焦顯微鏡是在熒光成像的基礎上加裝激光，激光掃描器，針孔等裝置，使用可見光激光熒光探針結合計算機進行圖像處理，不僅可以觀察固定的細胞，組織切片還可以對活細胞的結構，分子，離子進行實時動態地觀察和檢測。

工作原理

下圖所示為激光熒光共聚焦顯微鏡的光路圖，輸出激光通過照明針孔再經由分色鏡反射到物鏡，最后聚焦到樣品表面，激光會與生物組織樣本中的熒光物質相互作用產生熒光，部分熒光信號會沿著入射光路相反方向通過物鏡后進入二向色鏡（Beam Splitter），最終被探測器收集。由于針孔與樣品的焦平面處形成共軛關系，所以焦平面以外的反射信號會被針孔濾除，使得共聚焦顯微鏡具有一定的層析能力。經過針孔后的熒光信號具有較強的層析能力，同時由于光強較弱，需要使用靈敏度較高的光電探測器進行探測。光電倍增管可以將熒光信號放大并轉換為電信號（光電探測器輸出的電信號強度與熒光強度成正比）然后傳輸給電腦，電腦通過特定的處理方法將電信號轉換成圖像信息。

共聚焦顯微鏡的構成

激光器（Laser）

配置四條激光通道（405nm，488nm，561nm，638nm，波長可選）

二向色鏡（Dichromatic）

二向色鏡作為一個濾光片（Filter）可將熒光中摻雜的激光分離出來，以便于熒光的后續處理。

XY掃描鏡組（Scanner）

由一個或多個反射鏡組成的鏡組，用于引導聚焦后的激光在樣本上進行點對點（Pixel-by- pixel）和行對行（Line- to- line）的掃描。

針孔（Pinhole）

用于提高共聚焦顯微鏡的層析能力，可濾除焦點以外的熒光信號。

應用

如下圖所示，使用激光共聚焦顯微鏡對花粉進行3D成像，激發光源為488納米激光，通過將一張張光學切片按順序重構可以得到下圖所示的三維圖像。

Time Lapse(延時功能）