激光熒光共聚焦顯微鏡的應用

激光熒光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡的基礎上加裝激光掃描裝置，可以利用可見光對熒光探針進行激發，再利用計算機圖像處理技術獲得細胞的圖像。激光熒光共聚焦顯微鏡不僅可以觀察固定的細胞、組織切片，還可以對活細胞的結構、分子、離子進行實時動態觀察和檢測。

一.Z-STACK 三維構建

激光熒光共聚焦顯微鏡采用的是類似于連續斷層掃描的方法，即通過移動Z軸獲得一張張連續的光學切片，通過計算機可以將這些光學切片重新組構建成一張三維圖像（可做單色或多色圖像處理組合成細胞真實的三維結構）。通過旋轉，可觀察細胞各個側面的表面形態，也可以從斷面觀察細胞的內部結構，測量細胞的長寬高，體積，細胞數量統計等功能。通過shadow功能，可以去除細胞上的陰影，突出細胞的立體效果。LSCM的Z-STACK廣泛應用于細胞骨架，細胞凋亡，細胞器等的細胞結構分析中。

二. 細胞靜態結構檢測，原位鑒定細胞或組織內生物大分子觀察

1.檢測細胞凋亡

2.細胞原位檢測核酸

細胞核定位及其形態學觀察，檢測細胞內DNA的復制及斷裂情況以及染色體定位觀察

3.細胞器觀察及測定

4.觀察細胞骨架結構

5.檢測細胞內脂肪

6.檢測細胞融合

三.動態觀察

1.實時定量測定細胞內鈣的變化

2.測定細胞內PH的變化

激光共聚焦顯微鏡是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分布成為可能。利用熒光探針，可測量單個細胞內PH和多種離子（Ca+，K+，Na+，Mg2+）在活細胞內的濃度及變化。一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術可以快速檢測細胞內離子量變化，激光共聚焦技術可以提供更好的亞細胞結構中Ca+濃度的動態變化圖像，對研究Ca+細胞內動力學有意義。

3.檢測膜電位的變化

JC-1 低電位下單體存在，發綠色的熒光，高電位下J-聚集體發紅色的熒光，隨電位增加，紅色熒光也增加。

4.檢測細胞內活性氧物種的產生

5.藥物篩選

對藥物，病毒，細菌等進行熒光標記，當檢測藥物跨膜進入組織或細胞中時，可檢測藥物是否進入，位置含量以及動態過程。

6.細胞間的通訊研究

激光共聚焦顯微鏡可通過觀察細胞縫隙連接分子的轉移來測量傳遞細胞調控信息的一些離子，小分子物質。該技術可以用于研究胚胎發育，生殖發育，神經生物學，腫瘤發生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用，也可以用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學物質。

7.觀察細胞遷移和生長

LSCM已經極大地提高了光子產生效率，樣品可以與更小毒性的染料結合減少每次掃描時激光束對細胞的損傷，可用于數小時的長時程定時掃描，記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象。

8.檢測熒光漂白的恢復

當一個細胞內的熒光分子被激光漂白或淬滅失去發光能力，臨近細胞中未被淬滅的熒光分子可以通過細胞間的縫隙擴散到已經被漂白的細胞中，從而恢復熒光。該技術可用于分析分析細胞內蛋白質運輸，受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。